Analyse des stéroïdes

Analyse des stéroïdes par spectrométrie de masse en tandem couplée à la chromatographie en phase gazeuse

Spécialisée dans l’analyse des neurostéroïdes, cette plateforme permet de caractériser l’ensemble du stéroïdome, à partir de tissus du système nerveux central et périphérique ainsi que de fluides biologiques d’origine animale ou humains.

Activités

La plateforme technologique de chimie analytique permet de caractériser un stéroïdome complet à partir de tissus et de fluides biologiques grâce à la technologie de pointe de la spectrométrie de masse en tandem quadripolaire couplée à la chromatographie en phase gazeuse de très haute résolution (GC-MS/MS). C’est aujourd’hui la technologie de référence la plus sensible (jusqu’à la femtomole), et précise pour déterminer une cartographie stéroïdienne permettant d’analyser jusqu’à 80 stéroïdes, incluant les progestagènes, androgènes, estrogènes, gluco- et minéralocorticoïdes, stéroïdes sulfates, oxystérols, la vitamine D ainsi que tous leurs précurseurs et métabolites. La spécificité de cette technologie permet de caractériser sans ambiguïté des stéroïdes de structure très proche tels que les isomères de position ou les stéréoisomères.

La combinaison d’un protocole de traitement d’échantillon incluant les étapes d’extraction,  d’extraction en phase solide (SPE) et de chromatographie liquide haute performance (HPLC), avec l’analyse proprement dire par GC-MS/MS, permet d’analyser des stéroïdes avec des propriétés physicochimiques très différentes dans tout type de tissus (quelques mg) tels que les sous-régions cérébrales, glandes surrénales, testicules, foie, sur des organismes entiers (C. Elegans, poisson zèbre…) ainsi que tout type de fluides biologiques (25-50 µl) tels que plasma, salive, liquide céphalo-rachidien et urine, avec une très grande fiabilité. L’introduction de stéroïdes marqués aux isotopes stables (¹³C- ou ²H) comme standards internes donne accès à une quantification très précise sur toute la gamme de stéroïdes.

L’expertise de notre groupe est reconnue au niveau national et international et notre plateforme est au centre de très nombreuses collaborations que ce soit en recherche fondamentale ou clinique. Nous réalisons des analyses dans le cadre des projets de recherche de l’unité, avec des partenaires académiques extérieurs nationaux (INSERM, CNRS, INRAE) et internationaux. Nous avons également des collaborations pour des études cliniques (CHU du Kremlin-Bicêtre, hôpital Tenon) et réalisons des prestations pour des partenaires industriels nationaux et internationaux. Notre plateforme est unique et reconnue internationalement dans les domaines de l’endocrinologie, la neuroendocrinologie et les neurosciences, et est à l’origine de découvertes majeures sur différentes pathologies que ce soit dans des modèles expérimentaux animaux (souris, rat…) ou humains.

La plateforme analytique est composée de 2 laboratoires. Un laboratoire est dédié aux différentes étapes de préparation d’échantillon, pour l’extraction, le fractionnement et la purification des extraits biologiques. Le second laboratoire est dédié à la dérivation chimique des stéroïdes et à l’analyse par spectrométrie de masse.

Le laboratoire de préparation d’échantillons est équipé d’une ultracentrifugeuse, d’un bain à sonication, d’un bain-marie chauffé à 60°C et surmonté d’un système d’évaporation sous air comprimé pour l’étape d’extraction à partir de tissus et de fluides biologiques, et de 3 sorbonnes chimiques. Il est également composé d’un système d’Extraction en Phase Solide (SPE) qui permet, par adsorption sélective des stéroïdes suivant leurs propriétés physicochimiques sur une phase solide hydrophobe, de purifier les extraits biologiques en éliminant la majorité des composés plus hydrophiles et plus hydrophobes tout en isolant les stéroïdes les plus hydrophiles (stéroïdes sulfates) des stéroïdes non conjugués. Le dispositif SPE permet de traiter 24 échantillons simultanément et de réaliser la filtration des extraits biologiques. Ces derniers sont ensuite à nouveau purifiés et fractionnés par Chromatographie en Phase Liquide Haute Performance (HPLC) couplée à un collecteur de fractions. Cette étape permet d’isoler les stéroïdes cétoniques plus apolaires des stéroïdes hydroxylés plus polaires car l’étape ultérieure de dérivation chimique est spécifique de la structure chimique des stéroïdes.

La plateforme est composée de 3 spectromètres de masse

– un spectromètre de masse de type quadripolaire couplé à un chromatographe en phase gazeuse (GC-MS) TRACE 1300 – ISQ (ThermoFisher) qui permet la mise au point de l’identification des stéroïdes et l’analyse des stéroïdes sulfates.

– deux spectromètres de masse en  tandem quadripolaire couplé à un chromatographe en phase gazeuse (GC-MS/MS) : TRACE 1300 – TSQ8000 (ThermoFisher) et TRACE 1300 – TSQ9000 (ThermoFisher). La GC-MS/MS est la technique de référence en termes de sensibilité et de spécificité pour identifier et quantifier les stéroïdes dans les extraits biologiques purifiés.

Equipe

Resp. Opérationel. Philippe LIERE (ingénieur de recherche, Philippe.Liere@inserm.fr)

Antoine PIANOS (ingénieur d’étude)

Maria Sanchez Garcia (assistante ingénieure, CDD)

Resp. Scientifique. Michael Schumacher (DR1, Michael.Schumacher@inserm.fr)

Principales publications

– Liere P, Liu GJ, Pianos A, Middleton RJ, Banati RB, Akwa Y. 2023. The Comprehensive Steroidome in Complete TSPO/PBR Knockout Mice under Basal Conditions. International J. Molecular Sciences. 24, 2474.

– Fernandez N, Petit A, Pianos A, Haddad L, Schumacher M, Liere P, Guennoun R. 2023. Aging Is Associated With Lower Neuroactive Steroids and Worsened Outcomes Following Cerebral Ischemia in Male Mice. Endocrinology.164, 1–24.

– Goudet G, Douet C, Pianos A, Haddad L, , Reigner F, Deleuze S, Liere P. 2022. Saliva and plasma steroidome in mare during reproductive stages: A GC-MS/MS study. Frontiers in Animal Science. 3, 10.3389/fanim.1055179.hal-03841907.

– Vacher CM, O’Reilly JJ, Salzbank J, Lacaille H, Bakalar D, Sebaoui-Illoul S, Liere P, Clarkson-Paredes C, Sasaki T, Sathyanesan A, Imamura Kawasawa Y, Popratiloff A, Hashimoto-Torii K, Gallo V, Schumacher M, Penn AA. 2021. Placental neurosteroids shape cerebellar development and social behavior. Nature Neuroscience. 24, 1392-1401.

– Liere P, Cornil CA, de Bournonville MP, Pianos A, Keller M, Schumacher M, Balthazart J. 2019. Steroid profiles in quail brain and serum: Sex and regional differences and effects of castration with steroid replacement. J Neuroendocrinol. Feb;31(2):e12681

– Berkane N, Liere P, Lefevre G, Alfaidy N, Nahed RA, Vincent J, Oudinet JP, Pianos A, Cambourg A, Rozenberg P, Galichon P, Rousseau A, Simon T, Schumacher M, Chabbert-Buffet N, Hertig A. 2018. Abnormal steroidogenesis and aromatase activity in preeclampsia. Placenta. Sep;69:40-49.

– Guennoun R, Fréchou M, Gaignard P, Liere P, Slama A, Schumacher M, Denier C, Mattern C. 2019. Intranasal administration of progesterone: A potential efficient route of delivery for cerebroprotection after acute brain injuries. Neuropharmacology. Feb;145(Pt B):283-291.

– Zhu X, Fréchou M, Liere P, Zhang S, Pianos A, Fernandez N, Denier C, Mattern C, Schumacher M, Guennoun R. 2017. A Role of Endogenous Progesterone in Stroke Cerebroprotection Revealed by the Neural-Specific Deletion of Its Intracellular Receptors. J Neurosci. Nov 8;37(45):10998-11020.

– Liere P, Pianos A, Oudinet JP, Schumacher M, Akwa Y. 2017. Differential effects of the 18-kDa translocator protein (TSPO) ligand etifoxine on steroidogenesis in rat brain, plasma and steroidogenic glands: Pharmacodynamic studies. Psychoneuroendocrinology. 83:122134.

– Gonzalez Deniselle MC, Liere P, Pianos A, Meyer M, Aprahamian F, Cambourg A, Di Giorgio NP, Schumacher M, De Nicola AF, Guennoun R. 2016. Steroid Profiling in Male Wobbler Mouse, a Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Endocrinology. 157(11):4446-4460.

– Liere P, Schumacher M. 2015. Mass spectrometric analysis of steroids: all that glitters is not gold. Expert Rev Endocrinol Metab 10:463-465.

– Schumacher M, Guennoun R, Mattern C, Oudinet JP, Labombarda F, De Nicola AF, Liere P. 2015. Analytical challenges for measuring steroid responses to stress, neurodegeneration and injury in the central nervous system. Steroids. 103/42-57. Review

– Liu A, Margaill I, Zhang S, Labombarda F, Coqueran B, Delespierre B, Liere P, Marchand-Leroux C, O’Malley BW, Lydon JP, De Nicola AF, Sitruk-Ware R, Mattern C, Plotkine M, Schumacher M, Guennoun R. 2012. Progesterone receptors: a key for neuroprotection in experimental stroke. Endocrinology. 153(8):3747-57.

– Hertig A, Liere P, 2010. New markers in preeclampsia. Clin Chim. Acta, 411, 1591-1595.

– Hertig A, Liere P, Chabbert-Buffet N, Fort J, Pianos A, Eychenne B, Cambourg A, Schumacher M, Berkane N, Lefevre G, Uzan S, Rondeau E, Rozenberg P, Rafestin-Oblin ME. 2010. Steroid profiling in preeclamptic women:evidence for aromatase deficiency. Am. J. Obstet. Gynecol., 203(5): 03(5):477.e1-9.

– Liere P, Pianos A, Eychenne B, Cambourg A, Bodin K, Griffiths W, Schumacher M, Baulieu EE, Sjövall J. 2009. Analysis of pregnenolone and dehydroepiandrosterone in rodent brain: cholesterol autoxidation is the key. J Lipid Res. 50(12):2430-44.

– Schumacher M, Liere P, Akwa Y, Rajkowski K, Griffiths W, Bodin K, Sjövall J, Baulieu EE. 2008. Pregnenolone sulfate in the brain: a controversial neurosteroid. Neurochem Int. 52(4-5):522-40.

– Meffre D, Pianos A, Liere P, Eychenne B, Cambourg A, Schumacher M, Stein DG, Guennoun R. 2007. Steroid profiling in brain and plasma of male and pseudopregnant female rats after traumatic brain injury: analysis by gas chromatography/mass spectrometry. Endocrinology. 148(5):2505-17.

– Broué F, Liere P, Kenyon C, Baulieu EE. 2007. A steroid hormone that extends the lifespan of Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 6(1):87-94.

– Liere, P., A. Pianos, B. Eychenne, A. Cambourg, S. Liu, W. Griffiths, M. Schumacher, J. Sjovall and E. E. Baulieu. 2004. Novel lipoidal derivatives of pregnenolone and dehydroepiandrosterone and absence of their sulfated counterparts in rodent brain. J Lipid Res., 45, 2287-2302.

– Weill-Engerer, S., J. P. David, V. Sazdovitch, P. Liere, B. Eychenne, A. Pianos, M. Schumacher, A. Delacourte, E. E. Baulieu and Y. Akwa. 2002. Neurosteroid quantification in human brain regions: comparison between Alzheimer’s and nondemented patients. J Clin Endocrinol Metab. 87: 5138-43.

– P. Liere, Y. Akwa, S. Weill-Engerer, B. Eychenne, A. Pianos, P. Robel, J. Sjövall, M. Schumacher and E.E. Baulieu, 2000, Validation of an analytical procedure to measure trace amounts of neurosteroids in brain tissue by gas chromatography-mass spectrometry, Journal of Chromatography B., 739, 301.